生物醫(yī)學研究領域的熒光顯微鏡通常關注一系列不同顏色發(fā)射的相關性。不同的顏色代表特定染色的結構或代謝參數(shù)。生物學是研究生物體的科學，而生物體即使在微觀尺度上也在運動。這一事實不僅適用于快速移動的原生動物，也適用于被認為是靜態(tài)的個體，如植物。細胞區(qū)室、蛋白質和代謝分子通常用不同顏色的熒光標記物進行標記。多光子顯微鏡增加了其他選項，如二次和三次諧波生成。這些顏色通道最好是同時記錄，即并行記錄，以保持它們在高度動態(tài)變化的環(huán)境中的相關性。通過這種方式，同時記錄保留了被研究生物參數(shù)之間的時間和空間相互關系，并且提高了時間分辨率。這需要多個光傳感器用于不同的顏色通道，這些傳感器并行工作，并同時提供相關光譜的光的分數(shù)。

替代方案是順序記錄，其中為不同的光譜分數(shù)提供一個單一傳感器，依次記錄每個分數(shù)的圖像并隨后疊加。使用順序方法，不僅可能會喪失空間和時間的相關性，而且時間分辨率也降低，降低的幅度至少等于記錄參數(shù)的數(shù)量。因此，整個數(shù)據(jù)采集所需的時間要長得多：按相同的比例。

同時記錄光譜發(fā)射分數(shù)的經(jīng)典解決方案是使用二色光束分割鏡和阻擋濾光片的排列。這種設計的缺點是，對于更改的染料組合，系統(tǒng)必須提供適當?shù)臑V光配置，使其成為一種成本高、速度慢且不靈活的解決方案。

對于單通道系統(tǒng)，這種不靈活性通過使用光譜設備——光譜儀被消除了。1997 年，徠卡激光技術公司推出了第一款具有自由可調檢測通道的多通道光譜設備，允許共聚焦顯微鏡同時記錄不同顏色的圖像：SP 探測器。^[1]

該 SP 探測器解決方案用于共聚焦顯微鏡，采用一個棱鏡將檢測光分成其光譜成分，并通過一組級聯(lián)光譜儀狹縫將可調帶傳遞到傳感器。電動屏障由反射鏡制成，因此可以將互補部分進一步引導到傳感器上。通過這種方式，完整的光譜可以被切割成多個部分，每個部分可以進行微調，以實現(xiàn)通道的最佳分離，而無需進行復雜的計算。這個概念依賴于共聚焦顯微鏡中發(fā)射光束是靜止的這一事實。掃描運動通過掃描鏡進行補償，發(fā)射的光以相反的方向經(jīng)過這些鏡子。然后，靜止的光束通過檢測針孔，生成光學切片。

然而，在多光子顯微鏡中，光學切片是通過光子的非線性相互作用產(chǎn)生的，這種相互作用在焦平面上具有足夠的密度。因此，不需要針孔，發(fā)射的光可以在通過掃描設備之前被檢測到，即非掃描檢測。這種方法對于成像深處的渾濁物體（如許多生物樣本）尤其重要，因為它們表現(xiàn)出顯著的散射，導致光子損失。使用非掃描探測器，收集效率大大提高，圖像更加清晰，研究人員可以更深入地觀察標本。然而，這一概念沒有靜態(tài)光束，這導致光譜在棱鏡和光譜儀狹縫上晃動，從而導致位置依賴的光譜響應。

在瞳孔平面（參見圖 3 中的 P），它與顯微鏡物鏡的后焦平面重合，位置是固定的，但角度隨著掃描過程不斷變化。這個關系被用來方便地掃描樣本，而不需要移動標本或光源。掃描鏡被放置在與后焦平面共軛的平面中。當掃描時，鏡子改變光束角度，這會導致焦平面中的位置變化。

在任何像 G 這樣的平面中，位于 F 和 P 之間，角度和位置都隨著掃描而變化。

如果我們將梯度濾光片放置在與場共軛的平面中，那么由于變化的位置我們將會有顏色變化。在與瞳孔共軛的平面中，由于變化的角度我們將會有顏色變化。

但是，如果我們將濾光器放在一個合適的位置（圖 3 中的位置 G），并且如果我們合理設計濾光器涂層，那么我們可以使這兩種效果相互抵消 ^[2]。光束路徑和濾光器的設計計算有些繁瑣，但最終會得到一個實用的解決方案。這些結果是通過徠卡顯微系統(tǒng)的 4Tune 探測器實現(xiàn)的。

圖 6： 使用 4Tune 探測器的多光子顯微鏡拍攝的鼠皮膚切片圖像。Lgr5CreERT2-GFP 彩色斑點小鼠的小腸?；疑篠HG 信號（膠原蛋白 1），綠色：Lgr5+干細胞。紅色、藍色和黃色，追蹤的細胞是 Lgr5 干細胞的后代。樣本由荷蘭烏特勒支的 Jacco van Rheenen 提供。